Choroby bakteryjne w sadach – diagnostyka molekularna kluczem do ochrony z sukcesem
Wszyscy producenci owoców znają takie choroby, jak zaraza ogniowa, rak bakteryjny czy guzowatość korzeni. W internecie i książkach jest mnóstwo ich zdjęć i opisów. A zatem prawidłowa identyfikacja kilku istotnych gospodarczo chorób bakteryjnych, w porównaniu z różnorodnością grzybów porażających sady w Polsce, pozornie powinna być prosta. Jednak ich diagnostyka nadal stanowi problem. Jakie się tego przyczyny?
Izabela Abramczyk/Instytut Agronomiczny Fertico
Najczęściej występujące gatunki bakterii patogennych dla roślin sadowniczych należą do rodzajów: Agrobacterium, Pseudomonas, Erwinia, Xanthomonas, Xylella. Natomiast najpowszechniej odnotowywanymi chorobami bakteryjnymi w sadach w Polsce są zaraza ogniowa (sprawca – Erwinia amylovora), rak bakteryjny drzew owocowych (sprawca – Pseudomonas syringae pv. syringae oraz Pseudomonas syringae pv. morsprunorum), guzowatość korzeni (sprawca – Agrobacterium tumefaciens).
Choroby bakteryjne w sadach – charakterystyka
Zaraza ogniowa
To choroba, która poraża przede wszystkim jabłonie i grusze. Objawia się brązowieniem lub czernieniem liści i kwiatów i ich pozostawaniem na drzewach oraz zamieraniem pędów i charakterystycznym ich wyginaniem się w kształt pastorału, występowaniem zgorzeli na zdrewniałych częściach drzew oraz pojawianiem się brunatnoczarnych plam na powierzchni owoców. Nazwa choroby wzięła się od wyglądu silnie porażonych pędów i liści, które wyglądają jak spalone. Bakteria Erwinia amylovora zimuje w porażonych drzewach, najczęściej w okolicy zgorzeli. Wnika do nowej rośliny poprzez naturalne otwory – szparki, przetchlinki, a także przez uszkodzenia mechaniczne. Czynnikami sprzyjającymi rozwojowi choroby są wysoka wilgotność i temperatura (optymalna to 20–24°C). Patogen może być przenoszony z kroplami deszczu oraz przez wektory – ptaki, owady.
Rak bakteryjny
Infekuje głównie drzewa pestkowe – czereśnie, wiśnie, morele, brzoskwinie. Podobnie jak w przypadku zarazy ogniowej, porażone kwiaty zamierają i nie opadają. Natomiast na zainfekowanych liściach pojawiają się małe, jakby nasiąknięte wodą plamki, które stopniowo zasychają i zmieniają się w nekrozy. Nazwa choroby pochodzi od najbardziej typowych dla niej objawów – zrakowaceń na pędach, którym często towarzyszą wycieki gumy. Bakterie Pseudomonas syringae pv. syringae i Pseudomonas syringae. pv. morsprunorum zimują na powierzchni pędów, w pąkach i miękiszu korowym porażonych drzew. Przenoszą się w obrębie rośliny wraz z sokiem roślinnym. Duże znaczenie mają infekcje wiosenne kwiatów oraz jesienne pędów (przez blizny po opadłych liściach).
Guzowatość korzeni
Powodująca ją bakteria Agrobacterium tumefaciens jest powszechnym polifagiem, co zwiększa niebezpieczeństwo wystąpienia choroby z uwagi na liczne źródła inokulum patogenu. Guzowatość korzeni objawia się występowaniem na korzeniach i szyjce korzeniowej gładkich, jasnobrunatnych, miękkich narośli, które z czasem szybko rosną i stają się brunatne, twarde, a ich powierzchnia często pęka, uwalniając bakterie do gleby, gdzie mogą przetrwać saprotroficznie przez wiele lat. Na skutek występowania guzów przewodzenie wody i soli mineralnych jest utrudnione, co ogranicza wzrost i rozwój drzew. Agrobacterium tumefaciens infekuje korzenie przez przetchlinki lub uszkodzenia mechaniczne. Warunkami sprzyjającymi rozwojowi bakterii są ciężkie, alkaliczne gleby oraz temperatura w granicach 23–25oC.
Inne groźne organizmy. Nie należy zapominać także o organizmach, które stanowią poważne zagrożenie dla polskich sadów ze względu na niebezpieczeństwo szerokiego rozprzestrzenienia się – są to m.in.: Xanthomonas arboricola pv. pruni, Xanthomonas arboricola pv. corylina, Xylella fastidiosa, znajdujące się na liście A2 EPPO (Europejskiej i Śródziemnomorskiej Organizacji Ochrony Roślin).
Diagnostyka – przyczyny problemów
Często rozpoznanie sprawcy choroby po samych objawach na roślinie jest niemożliwe, m.in. ze względu na:
- ich mało specyficzny charakter,
- stan materiału roślinnego,
- infekcje wtórne spowodowane np. przez patogeny grzybowe.
Bardzo ważna jest charakterystyka oznak etiologicznych, które mogą, ale nie muszą towarzyszyć bakteriozom. Czym różnią się objawy od oznak etiologicznych? Objawy to zmiany na roślinie, będące skutkiem infekcji – w przypadku chorób bakteryjnych są to m.in.: więdnięcie, plamistość liści, wyginanie się pędów, zrakowacenia pędów, narośle. Natomiast oznaki etiologiczne chorób bakteryjnych to komórki bakterii w postaci wycieków śluzowatych kropli lub gumy. Ich występowanie zależy od warunków atmosferycznych, czasu, który upłynął od porażenia roślin, rodzaju i wieku porażonej tkanki.
Objawy bakterioz można mylić z tymi powodowanymi przez inne gatunki bakterii lub przez grzyby. Przykładem są zgorzele i nekrozy na drzewach jabłoni, mogące świadczyć zarówno o obecności chorób bakteryjnych (zaraza ogniowa, rak bakteryjny drzew owocowych), jak i grzybowych (rak drzew owocowych, zgorzel kory jabłoni). Sprawcą zgorzeli kwiatów wiśni i czereśni może być rak bakteryjny drzew owocowych lub brunatna zgnilizna drzew pestkowych. Dziurkowatość liści drzew pestkowych może być mylona z objawami raka bakteryjnego, jeśli na pniu dodatkowo występują zrakowacenia. Bakteryjna zgorzel orzecha włoskiego (powodowana przez Xanthomonas arboricola pv. juglandis) daje objawy podobne do antraknozy orzecha włoskiego. Obu chorobom towarzyszy plamistość liści.
Diagnostyka molekularna – podstawa ochrony
Jeśli po obserwacji objawów i oznak etiologicznych nadal są wątpliwości co do sprawcy choroby, warto wykonać badania molekularne w specjalistycznym laboratorium (np. w Instytucie Agronomicznym Fertico – zeskanuj kod QR). Potwierdzą one lub wykluczą obecność patogenu w tkance roślinnej, nawet w przypadku nietypowych lub dopiero co rozpoczynających się objawów. Do wykonania takich badań wystarczy niewielka ilość tkanki roślinnej, ale musi to być próbka reprezentatywna – tzn. charakteryzować się objawami typowymi dla całej populacji. Można przebadać także roślinę niewykazującą objawów, żeby sprawdzić, czy patogen występuje w tkance. W przypadku podejrzenia wystąpienia guzowatości korzeni do analizy można pobrać zarówno fragment rośliny, jak i glebę – z miejsca, w którym objawy zostały zaobserwowane. Glebę warto też zbadać na obecność bakterii przed posadzeniem sadu na danym stanowisku.
Po dostarczeniu próbki do badań dokonywana jest wstępna ocena morfologiczna materiału – czy objawy wskazują na możliwość wystąpienia choroby bakteryjnej. Jeśli tak, pobierana jest próbka roślinna lub próbka glebowa i poddawana procesowi obróbki. Na samym początku należy zhomogenizować próbkę, poprzez ucieranie z dodatkiem ciekłego azotu lub przez rozdrabnianie za pomocą specjalnych, metalowych kulek. Właściwe rozdrobnienie próbki jest niezbędne do uzyskania odpowiedniej wydajności izolacji DNA. Do tak przygotowanej próbki dodaje się odczynniki mające na celu odzyskanie i oczyszczenie DNA patogenu. Następnie wyizolowane DNA poddaje się procesowi obróbki. Aby namnożyć wybrany fragment genu, który świadczy o obecności patogenu w próbce, przeprowadza się łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). W tym celu przygotowuje się mieszaninę ze ściśle określonych składników, która zawiera m.in.: sterylną wodę, specyficzne startery oraz DNA wyizolowane z próbki. Czym są startery specyficzne? To fragmenty kodu genetycznego patogenu, które przyłączają się tylko do jednego, określonego miejsca na każdej z nici DNA. Dzięki ich zastosowaniu ma się pewność, że nie przyłączą się one do innego, obcego DNA.
Sama reakcja PCR polega na wielokrotnym powtarzaniu trzech etapów zachodzących w różnych temperaturach. Liczbę takich cykli, a także czas ich trwania dostosowuje się do specyficznej reakcji. Pierwszym etapem jest denaturacja w wysokiej temperaturze (ok. 95oC), powodująca rozplecenie podwójnej nici DNA na dwie pojedyncze. Następnie do określonego fragmentu każdej z nici przyłączają się startery (tu temperatura musi być dostosowana do specyficznych starterów). Ostatnim etapem jest wydłużanie w temperaturze mniej więcej 72oC. Podczas tego etapu tworzy się nić komplementarna do matrycy, czyli DNA dla pożądanego genu się syntetyzuje. Po każdym kolejnym cyklu reakcja zachodzi coraz szybciej, ponieważ startery mogą przyłączać się także do zsyntetyzowanych fragmentów genu.
Po przeprowadzeniu reakcji PCR uzyskuje się produkt, który jest nakrapiany do zagłębień w żelu agarozowym (tzw. studzienek). Produkt opada na dno studzienki dzięki zmieszaniu z substancją o większej gęstości. Jako punktu odniesienia, aby zobaczyć, jaką wielkość ma produkt (jak długa jest zsyntetyzowana nić), używa się markera o znanej mobilności elektroforetycznej. Żel umieszcza się w aparacie do elektroforezy i zalewa buforem przewodzącym prąd. Po rozdziale elektroforetycznym dla produktu można zobaczyć prążek, widoczny po naświetleniu lampą ultrafioletową (UV). Dzieje się tak dlatego, że do żelu dodaje się barwnik, który absorbuje światło nadfioletowe. Prążek widoczny jest tylko w przypadku obecności patogenu w próbce i tylko, jeśli ma odpowiednią wielkość, jest produktem specyficznym dla danego patogenu.
W przypadku podejrzenia wystąpienia guzowatości korzeni do analizy można pobrać zarówno fragment rośliny, jak i glebę – z miejsca, w którym objawy zostały zaobserwowane.